PCR : La reacción en cadena de la polimerasa

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Introducción:

En muchas ocasiones, las investigaciones dedicadas al estudio del material genético y de sus variaciones requieren una cantidad relativamente grande del ADN en estudio. Es en estos momentos cuando la PCR resulta de gran utilidad.

La PCR utiliza la función natural de las polimerasas, enzimas presentes en los seres vivos cuya función es la de copiar el material genético, además de comprobar y corregir las copias. La PCR permite copiar un fragmento específico de ADN y funciona en mezclas complejas de material genético, identificando y multiplicando una secuencia particular a partir de cualquier muestra de ADN.

El proceso de la PCR le valió a su inventor, Kary Mullis, el Premio Nobel en 1993. En esta página mostramos cómo se lleva a cabo esta reacción y algunas de sus aplicaciones. Nos referimos a lo largo de toda la explicación al ADN como material genético de estudio, sin embargo, queremos señalar que también es posible el estudio del ARN con esta técnica, para ello sería necesario un paso previo de conversión del ARN a cDNA mediante una retrotranscripción.


Extracción de ADN
Podemos obtener una muestra de ADN de un ser vivo a partir de cualquier muestra biológica: sangre, tejido (animal o vegetal), pelo, semen, microorganismos, etc. En general, de cualquier muestra que contenga células nucleadas. En este ejemplo se muestra el proceso de obtención de ADN a partir de sangre

Realización del PCR
A la muestra de ADN se le añadirá una mezcla de reacción que contiene los componentes necesarios para conseguir copiar un fragmento determinado de ADN: cebadores, nucleótidos, Taq DNA polimerasa, tampón y agua ultrapura. Dependiendo de la técnica utilizada para la visualización del producto amplificado, a esta mezcla se pueden añadir: Cebadores o nucleótidos marcados con radiactividad, sondas marcadas con fluorescencia o moléculas fluorescentes intercalantes del ADN. Mostramos un ejemplo de realización de una mezcla de amplificación así como del proceso que tiene lugar durante la reacción de PCR. Esta reacción se realiza en un termociclador.

a>> Visualización del producto amplificado: Geles de Agararosa
Este método es sencillo y rápido sin embargo, no nos permite una gran resolución para identificar el tamaño específico del fragmento amplificado.

Utilización: 1. Comprobación del correcto funcionamiento de la reacción para el posterior procesado del producto amplificado: análisis con enzimas de restricción, secuenciación, etc 2. Diferenciación de los fragmentos conseguidos tras la digestión con enzimas de digestión (RFLPs).

Algunas aplicaciones prácticas: 1. Diagnóstico basado en la presencia o ausencia de una determinada secuencia: · Presencia de microorganismos en un alimento o en una muestra biológica. · Amplificación de fragmentos específicos del cromosoma Y para el diagnóstico del sexo. 2. Diagnóstico basado en la identificación de mutaciones puntuales mediante RFLPs.


b>> Visualización del producto amplificado: Autorradiografía
Este método requiere la incorporación de cebadores o nucleótidos radiactivos en la mezcla de amplificación. Combinado con una electroforesis en geles de acrilamida, permite una alta resolución en la separación de las bandas y asignación de tamaño al fragmento amplificado.

Utilización: Separación de fragmentos de ADN con diferencias de tamaño de unas pocas pares de bases, por ejemplo: distintos alelos de un marcador microsatélite o las bandas obtenidas en un proceso de secuenciación mediante PCR (secuenciación cíclica).

Algunas aplicaciones prácticas: Genotipado de marcadores microsatélites para identificación individual, análisis de ligamiento en pedigrís, etc.


c>> Visualización del producto amplificado: Secuenciador automático
Este método es similar al anterior con la diferencia de la incorporación de nucleótidos o cebadores marcados con fluorescencia. Este marcaje permite una mayor seguridad en el trabajo y la posibilidad de realizar una lectura automática del resultado.En este video se ha incorporado un fragmento de la animación de secuenciación cíclica de la web the Genetics Education Centre de University of Kansas Medical Center (http://www.kumc.edu/gec/).

Utilización y aplicaciones prácticas similares a las de la visualización mediante autorradiografía sin el inconveniente de la utilización de radiactividad.


d>> Visualización del producto amplificado: Tiempo real
La utilización de moléculas fluorescentes y sistemas que permiten la lectura de la luz emitida por las mismas, incorporados a los termocicladores comunes, ha posibilitado esta nueva metodología. Estos aparatos permiten conocer la cantidad de producto amplificado en cada uno de los ciclos, de esta manera podemos conocer la cantidad de producto de partida. En este video hemos inlcluído imágenes procedentes del CD Abi Prism 7000 Operator Training de Applied Biosystems.

Utilización: 1. Cuantificar de manera absoluta o relativa la cantidad o el número de copias de una secuencia determinada presentes en la muestra de ADN problema, a partir de la cual se realiza la PCR. 2. Muchas de las aplicaciones que se desarrollan con técnicas de visualizado tradicional (geles de agarosa).

Algunas aplicaciones prácticas: 1. Cuantificación de número de microorganismos patógenos presentes en la muestra. 2. Cuantificación de la expresión de un gen en muestras de distintos tejidos, distintos individuos o distintas condiciones de estudio. 3. Genotipado de mutaciones puntuales en un gen. 4.. Diagnóstico de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN en una mezcla compleja.