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Desarrollo histórico de la genética molecular y la ingeniería
genética.
Los orígenes de la genética molecular. Desarrollo e impacto en la
sociedad. |
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Herramientas
utilizadas en ingeniería genética.
Nucleasas. Endonucleasas
de restricción. Modificación por metilación. Enzimas de
modificación: DNA polimerasas, polinucleótido kinasa, DNA ligasa.
Transcriptasas inversas. PoliA polimerasa. |
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Vectores de clonaje en
sistemas procarióticos.
Plásmidos. Vectores
derivados de bacteriófagos y virus. Empaquetamiento. Cósmidos.
Vectores lanzadera. |
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Vectores de clonaje en
sistemas eucarióticos.
Levaduras como huésped.
Vectores autorreplicativos. Vectores integrativos: disrrupción
génica, reemplazamiento génico. Vectores centroméricos. Vectores
lineales. Cromosomas artificiales (YAC´s). Vectores de clonaje en
plantas: Sistemas basados en el plásmido p-Ti. Vectores de clonaje
en animales: Vectores SV 40. Vectores basados en el virus del
papiloma bovino. Vectores basados en retrovirus. |
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Adquisición de nuevos
genes:
Transformación,
conjugación y transducción en bacterias. Recombinación
sito-específica. Transposición. Transfección en plantas.
Transformación de células animales |
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Extracción y
purificación de DNA cromosómico y plasmídico.
Técnicas de extracción de
DNA cromosómico. Aislamiento de plásmidos, cósmidos y fagos.
Purificación del recombinante. Análisis en geles de agarosa.
Electroforesis de campo pulsado. |
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Hibridación de ácidos
nucléicos:
Técnicas de Southern y
Northern. “Dot blot”. Polimorfismo de los fragmentos de restricción
(RFLP). Métodos de detección de DNA y RNA hibridados |
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Estrategias de clonaje:
Construcción de una
genoteca. Insertos de DNA genómico. Insertos sintéticos. Insertos de
c-DNA. Ligación vector-inserto: extremos cohexivos y romos. Adición
de “linkers” y adaptadores. Selección de clones recombinantes. |
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Caracterización del
DNA recombinante:
Tamaño del inserto. Mapeo
de sitios de restricción. Subclonación. Localización de segmentos
clonados en el genoma. Localización cromosómica. Determinación del
número de copias de una molécula de DNA en el genoma. |
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Amplificación
enzimática de fragmentos de DNA y RNA.
Fundamentos de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Diseño de iniciadores (“primers”)
y síntesis de oligonucleótidos. Variantes de la PCR. Aplicaciones. |
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Técnicas de
secuenciación del DNA.
Secuenciación enzimática
y secuenciación química. Secuenciación cíclica. Estrategias de
secuenciación. |
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Interacciones
covalentes de los ácidos nucléicos con pequeñas moléculas.
Hidrólisis. Reacciones de
oxidación y de reducción. Reacciones con carcinógenos activados
metabólicamente. Reacciones con anticarcinógenos. Modificación
fotoquímica de los ácidos nucléicos. Efectos de la radiación
ioniozante.Consecuencias biológicas de la alquilación del DNA. |
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Interacciones
reversibles de los ácidos nucléicos con pequeñas moléculas.
Interacciones
electrostáticas externas. Unión al surco (groove-binding).
Intercalación. Interacciones del RNA. Estructuras multihélice. |
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Mutaciones.
Clases de mutagénesis
fenotípicas. Mutagénesis a nivel molecular. Mutágenos. Sistemas de
reparación del DNA. Detección de mutaciones. Mutagénesis dirigida:
métodos y aplicaciones. |
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Sistemas de expresión
del DNA recombinante.
Transcripción y
traducción in vitro. Determinación de puntos de inicio y terminación
de la transcripción. Sistemas de expresión de proteínas
recombinantes in vivo. Detección de los productos de expresión.
Análisis de Western. Fusiones a genes informadores (reporter genes)
para el análisis de promotores. Optimización de la expresión de
proteínas recombinantes. |
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Purificación de
proteínas sobreexpresadas.
Factores que influyen en
las propiedades físicas de las proteínas sobreexpresadas en células
de E. coli. Purificación de proteínas a partir de cuerpos de
inclusión. Procesamiento de las proteínas de fusión. Purificación de
proteínas que se unen específicamente con ácidos nucléicos: Análisis
de la unión de fragmentos clonados y proteínas: Ensayos de
protección y modificación. “South-western blot”. Métodos de ensayo
de la unión DNA-proteína “in vivo”. Aplicaciones de la
sobreexpresión de proteínas recombinantes |
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Interacciones
proteína-ácidos nucléicos: herramientas de estudio.
Proteínas
reguladoras que se unen a DNA. Motivos estructurales. Elementos
reguladores en el DNA. Secuencias de reconocimiento. Interacciones
RNA-proteína. Metodología de estudio: Métodos de resolución.
Estrategias de purificación. |
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Ordenadores y Biología
Molecular.
Bases de datos de
secuencias de ácidos nucléicos y proteínas. Ensamblaje de secuencias
de DNA. Análisis de secuencias de DNA. Predicción de los niveles de
expresión a través de la secuencia de nucleótidos. Apoyos
informáticos para el análisis de secuencias de proteínas. |
